Питательная среда левина. Среда левина-грм оболенск. IV. Сотрясение Левина

Среда Раппопорта является средой обогащения и дифференциально-диагностической средой. В ее состав входит: желчный бульон 10%, 2% глюкоза, индикатор (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью; в щелочной среде бесцветный, в кислой – красный). Назначение: для накопления тифо-паратифозных бактерий при посеве крови больного, а также для ориентировочной дифференциации тифо-паратифозных бактерий. Принцип д-я: при росте тифо-паратифозных бактерий из-за ферментации глюкозы происходит диффузное помутнение и покраснение среды. Для паратифозных бактерий, в отличие от брюшно-тифозных, наличие в поплавке газа.

Среда Эндо – дифференциально-диагностическая. Состав: МПА, лактоза, индикатор – основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Назначение: для рассева исследуемого материала с целью получения изолированных колоний. Принцип д-я основан на способности некоторых микроорганизмов разлагать или не разлагать лактозу (сальмонеллы не разлагают и образуют бесцветные колонии).

Среда Левина является слабо селективной и дифференциально-диагностической. В ее составе МПА, тактоза, индикаторы: эозин и метиленовый синий, калий гидрофосфат. Назначение и принцип д-я см. среду Эндо.

Среда Рессела Состав: МПА, лактоза 1%, глюкоза 0,1%, индикатор (водный голубой и розоловая к-та; в щелочной среде розовая, в кислой – синяя). Назначение: для отсева «подозрительных» колоний с целью выделения чистых культур и определения их ферментативной активности по отношению к глюкозе и лактозе. Принцип д-я:

Среда Клиглера – комбинированная, дифференциально-диагностическая. Состав: МПА, лактоза 1%, глюкоза 0,1%, натрий тиосульфат, железо II сульфат, индикатор – феноловый красный (в щелочной среде – красный, в кислой – желтый). Назначение: для отсева «подозрительных» колоний с целью выявления чистых культур и определения их ферментативной активности по отношению к глюкозе, лактозе и образования Н2S. Принцип д-я: энтеробактерии, имеющие фермент тиосульфат-редуктазу, восстанавливают тиосульфат в сульфит, при этом выделяется сероводород, который реагирует с железо-сульфатом – в рез-те образуется сульфид железа черного цвета.

Серологическая идентификация выделенной чистой культуры с помощью адсорбированных монорецепторных О- и Н- агглю­тинирующих сальмонеллезных сывороток. Серологическая идентификация проводится в реакции агглютинации на стеке с агглютинирующими адсорбированными сальмонеллезными О- и Н-сыворотками, эти сыворотки м.б. 2-х видов: монорецепторными и поливалентными, их получают из видовых иммунных сывороток методом адсорбции антител по Кастеллани.

Серологическая идентификация протекает последовательно в 3 этапа:

1) Установление принадлежности культуры к серогруппам А, В, С, D, Е, рода Salmonella. При этом используют поливалентную О-сыворотку, содержащую антитела против антигенных рецепторов 2, 3, 4, 7, 9, 10. Монорецепторные О-сыворотки применяют против редких серогрупп. При диагностике паратифа А и В, брюшного тифа можно использовать смесь О-сывороток, сорержащих антитела к рецепторам 2, 4, 9.

2) При положительном рез-те для определения принадлежности испытуемой культуры к определенной серогруппе ставят р-цию агглютинации раздельно с каждой монорецепторной О-сывороткой, входившей в состав поливалентной: рецептор 2 относится к серогруппе А, рецептор 4 – к серогруппе В, рецептор 7 – к серогруппе С и т.д.

3) После определения серогруппы, определяем ее видовую принадлежность при помощи р-ции агглютинации с адсорбированными монорецепторными Н-сыворотками против Н-антигенов 1-й фазы сальмонелл, входящих в состав данной серогруппы. Затем проводят р-цию агглютинации с адсорбированными Н-сыворотками против Н-антигенов 2-й фазы и окончательно устанавливают антигенную формулу испытуемой культуры.

Бактерионосительство при брюшном тифе. Какими серологи­ческими реакциями можно подтвердить хроническое бактерио­носительство? Диагностикумы, используемые для этой цели. Единственным доказательством бактерионосительства является выделение от носителя культур S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, с помощью вспомогательных методов: серологическая р-ция и алергическая кожная проба с Vi-тифином (он содержит Vi-антиген, который при взаимодействии с Vi-антителами дает местную аллергическую р-цию в виде покраснения и припухлости в течении 20-30 минут). Положительная р-ция с Vi-тифином говорит о том, что в орг-ме есть Vi-антитела и возможно S. typhi.

Хр. бактерионосительство подтверждается РНГА. При этом используются Vi-диагностикум, т.к. при формировании брюшнотифозного бактерионосительства хар-но проявление Vi-антител; диагностический титр р-ции 1:40.

Способы заражения брюшным тифом. Источник инфекции. Заражение брюшным тифом происходит только оральным путем. Источником инфекции являются больные люди и бактерионосители (представляют опасность для окружающих в течении нескольких лет после перенесенной болезни).

ЛЕВИНА СРЕДА (M. Levine, амер. бактериолог, род. в 1889 г.; син. агар с эозином и метиленовым синим ) - цветная элективная питательная среда для дифференцирования бактерий сем. Enterobacteriaсеае, используется при лабораторной диагностике дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезов и других кишечных инфекций. Впервые агар с эозином и метиленовым синим был предложен в 1916 г. Холт-Харрисом и Тигом (J. E. Holt-Harris, О. Teague), позднее, в 1918 г., состав среды был модифицирован Левином.

Л. с. наряду с другими твердыми цветными дифференциально-диагностическими питательными средами для энтеробактерий нашла широкое применение в лаб. практике. С ее помощью удается в сравнительно большом проценте случаев обнаружить патогенную лактозонегативную микрофлору. Готовая Л. с. довольно стабильна, не изменяет своих свойств на свету или при хранении на протяжении нескольких дней; при ее изготовлении не требуется точного установления концентрации водородных ионов (pH). Входящие в состав Л. с. органические красители избирательно задерживают рост грамположительных бактерий, благодаря чему она одновременно является средой обогащения и дает относительно лучшие результаты при непосредственном посеве исследуемого материала, даже если он содержит сравнительно малое количество патогенных бактерий.

В зависимости от качества отдельных ингредиентов (пептона и в особенности красителей) получаемые на Л. с. результаты могут несколько варьировать, поэтому при изготовлении каждой новой серии среды желательно использование материалов одной и той же марки, что значительно облегчает распознавание колоний.

Известно несколько прописей и способов приготовления Л. с. (Ю. А. Козлов, Г. Я. Синай, О. Г. Биргер и др.). Наибольшее распространение получил способ, при к-ром раздельно готовят основную среду, р-ры лактозы и красителей, пригодные для сохранения впрок и смешиваемые перед употреблением.

Основная среда состоит из 10 г бактериологического пептона, 15 г агар-агара, 2 г фосфата калия двузамещенного (K2HPO4) и 1 л дистиллированной воды. Ее стерилизуют в автоклаве при 1 ат 15-20 мин., pH не исправляют.

При приготовлении дифференциальной среды на каждые 100 мл расплавленной основной среды при постоянном помешивании добавляют приготовленные на дистиллированной воде и предварительно простерилизованные текучим паром (дробно, 3 дня подряд по 15-20 мин.) следующие р-ры в приведенной последовательности 5 мл 20% р-ра медицинской лактозы, 2 мл 2% р-ра эозина щелочного (бактериологического), 1,5 мл 0,5% р-ра метиленового синего. Готовую среду разливают в чашки Петри, слегка подсушивают и используют как обычно. Цвет среды сине-фиолетовый.

Колонии кишечной палочки на Л. с. небольшие, округлые, с гладкой блестящей поверхностью, темно-синего (до черного) цвета, иногда с металлическим блеском. Молодые колонии мутноватые, непрозрачные, могут быть окрашены только в центре. Колонии возбудителей дизентерии, брюшного тифа и паратифов относительно более мелкие, круглые, блестящие и прозрачные, обычно совершенно бесцветные (молодые) или с легким розоватым или голубоватым оттенком. Колонии протея ползучего роста не дают; они небольшие, изолированные, оранжево-желтого цвета. Среда меняет свой цвет только вокруг колоний протея.

Некоторые авторы рекомендуют увеличивать количество 0,5% р-ра метиленового синего до 2 мл на 100 мл основной среды или исключать из ее состава фосфатный буфер. Можно готовить среду не с пептоном, а на основе перевара Хоттингера, при pH 7,2-7,3 с добавлением соответствующего прописи количества агара и фосфорнокислого калия. Применение мясной воды для приготовления среды недопустимо, дифференциация колоний в этом случае значительно ухудшается.

Известен способ приготовления сухой Л. с., очень стабильной по качеству и особенно удобной для длительного хранения и в условиях экспедиционной работы (Н. В. Плоскирев).

Стабильная сухая Л. с. выпускается промышленностью, инструкция по ее изготовлению и применению рассылается вместе со средой. Большинство диагностических лабораторий применяет для выделения и дифференцирования патогенных энтеробактерий высококачественные стандартные элективные сухие питательные среды отечественного производства - Л. с., бактоагар Ж, среду Плоскирева (см. Плоскирева среда).

Библиография: Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 110, М., 1973; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 58, М., 1973; Levine М. The effect of concentration of dyes on differentiation of enteric bacteria on eosin- methylene- blue agar, J. Bact., v. 45, p. 471, 1943.

Г. П. Беликов.

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 37,5 г порошка М022 или 27,5 г порошка М301 в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Добавить соответствующий углевод к Основе агара Левина (М301) перед стерилизацией. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. НЕ ДОПУСКАТЬ ПЕРЕГРЕВАНИЯ СРЕДЫ. Остудить до 50°С и встряхнуть для окисления метиленового синего (чтобы восстановить его синий цвет и размешать хлопьевидный преципитат). Если среда используется в тот же день, ее можно не автоклавировать.

Предупреждение : среду надо хранить в темноте, чтобы не допустить ее окисления на свету.

Принцип и оценка результата:

Эта среда разработана Levine (1, 2) и используется для дифференциации Escherichia coli и Enterobacter aerogenes , а также для быстрой идентификации грибов Candida albicans . Американские специалисты рекомендуют эту среду для выделения, подсчета и дифференциации грамотрицательных микроорганизмов кишечной (колиформной) группы (3, 4, 5).

Метиленовый синий и эозин в определенной степени подавляют рост грамположительных микроорганизмов. Данные красители служат в качестве дифференцирующими индикаторами ферментации лактозы. На этой среде могут вырастать в виде точечных колоний дрожжи и некоторые грамположительные бактерии, например, энтерококки. Weld (6, 7) предложил использовать агар Левина с добавлением хлортетрациклина гидрохлорида для быстрой идентификации грибов Candida albicans в клиническом материале. Обнаружение этих грибов в таком материале, как фекалии, оральный и вагинальный секрет, ногти, чешуйки кожи и другом возможно через 24-48 ч инкубирования при 35-37°С в атмосфере, содержащей 10% углекислого газа. Однако культуральные свойства грибов при этом варьируют.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-лиловый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Готовая среда имеет красновато-лиловую окраску, опалесцирует с зеленоватым оттенком и легким преципитатом, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор М022 (3,75% вес/об) имеет рН 7,1 ± 0,2, водный раствор М301 (2,75% вес/об) имеет рН 7,3 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 24-48 ч при 35-37°С.

Практика

Плотные среды

Висмут-сульфит агар

______________________________________________

Паратиф А Сальмонеллез

Готовая среда непрозрачна зелено-горохового цвета. Строго селективная среда для выделения чистых культур сальмонелл. Salmonella typhi, Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium обычно образуют на этой среде черные колонии с металлическим блеском, окруженные зоной почернения в результате продукции сероводорода и восстановления сульфита до сульфида железа, имеющего черный цвет. Salmonella paratyphi A образует светло-зеленые колонии.

Эталон ответа: На плотной среде «Висмут-сульфит агар» обнаружены мелкие колонии. Гладкие с ровным краем, темные и непрозрачные с металлическим блеском.

______________________________________________

Среда Левина

Эталон ответа: На данной среде – среде Левина обнаружены мелкие гладкие колонии с ровным краем сине-фиолетового цвета с металлическим блеском, с ферментированием лактозы до кислоты. Индикатор – метиленовая синька. Предварительный диагноз – колиэнтерит, вызванный кишечной палочкой - Escherichia coli .

Эталон ответа: Данная среда – среда Левина, сделанная с целью получения изолированных колоний. На среде обнаружены мелкие гладкие прозрачные неокрашенные колонии, и ферментирование лактозы – отсутствует. Преддиагноз – дизентерия, вызванная возможными возбудителями:

Серогруппа A: Shigella dysenteriae (10 сероваров)

Серогруппа B: S. flexneri (6 сероваров и подтипы)

Серогруппа C: S. boydii (15 сероваров)

Серогруппа D: S. sonnei (1 сероваров)

______________________________________________

Среда Эндо

______________________________________________

Эталон ответа: Данная среда является средой Эндо. На ней обнаружены мелкие бесцветные, прозрачные, гладкие с ровным краем колонии. Разложение лактозы до кислоты отсутствует, о чем говорит данные цвет среды. Использован индикатор Андраде. Предполагаемый диагноз – брюшной тиф, вызванный Salmonella Typhi .

Эталон ответа: Данная среда используется для накопления изолированных колоний. Среда – Эндо. Обнаружены мелкие гладкие с ровным краем, красные с металлическим блеском из-за разложении лактозы до кислоты с использованием индикатора Андраде. Предварительный диагноз – колиэнтерит, вызванный кишечной палочкой - Escherichia coli .

______________________________________________

Методы определения чувствительности к антибиотикам

______________________________________________

Эталон ответа: В чашке Петри представлен метод определения чувствительности к антибиотикам – метод бумажных дисков, при котором на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35 о -37 о С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах.

Выделенная культура высоко чувствительна к мономицину, диаметр к задержке роста равен 30 мм, неомицина – 26 мм, канамицина – 20, а левомицитина – нет вообще. Характерно для кишечной палочкой - Escherichia coli .

______________________________________________

Посев из воздуха

______________________________________________

Эталон ответа: На данном пластинчатом агаре произведен посев из воздуха седиментационным методом. Показанием загрязненности воздуха закрытого помещения является общее количество бактерий на 1 кубический метр. Определяется количество бактерий за 10 минут. Для этого чашку Петри с пластинчатым МПА оставляют открытой на воздухе в течение 10 минут, затем инкубируют в термостате при температуре 37 градусов, сутки. Результаты подсчитывают по суммарному количеству колоний. Норма в операционной перед операцией равна – 3-5 колонии. После – 15. Также существует аспирационный метод, где воздух оценивают специальным прибором Кротового.

______________________________________________

Смесь микроорганизмов

______________________________________________

Цветной ряд

______________________________________________

Дизентерия

______________________________________________

МПБ (для опред протеолитических св-в): H2S-; Индол-;

Маннит: Кислота+; Газ-;

Мальтоза: Кислота+; Газ-;

Среда Пешкова: рост по уколу, цвет изменился в красный, что говорит о ферментации маннита до кислоты. Индикатор – Андраде;

______________________________________________

Кишечная палочка

______________________________________________

МПБ (для опред протеолитических св-в): H2S+(почернела); Индол+(покраснела);

Глюкоза: Кислота+; Газ+;

Лактоза: Кислота+; Газ+;

Мальтоза: Кислота+; Газ+;

Сахароза: Кислота-; Газ-;

Среда Пешкова: помутнение всего столбика (культура подвижна), цвет изменился в красный, что говорит о ферментации маннита до кислоты и наличие пузырьков газа. Индикатор – Андраде;

Среда Ресселя (Индикатор – бромтимоловый синий): Скос и столбик имеет желтый цвет, а в толще – газ, что свидетельствует о разложении лактозы и фруктозы до газа и кислоты.

Брюшной тиф

______________________________________________

Среда Гисса (Индикатор – водно-розоловый):

Глюкоза: Кислота+; Газ-;

Мальтоза: Кислота+; Газ-;

Маннит: Кислота+; Газ-;

Лактоза: Кислота-; Газ-;

Сахароза: Кислота-; Газ-;

Среда Пешкова: помутнение всего столбика (культура подвижна), цвет изменился в красный, что говорит о ферментации маннита до кислоты. Газ – отсутствует. Индикатор – Андраде;

______________________________________________

Сальмонеллез

______________________________________________

МПБ (для опред протеолитических св-в): H2S+(почернела); Индол-;

Среда Гисса (Индикатор – водно-розоловый):

Мальтоза: Кислота+; Газ-;

Сахароза: Кислота-; Газ-;

Среда Пешкова: помутнение всего столбика (культура подвижна), цвет изменился в красный, что говорит о ферментации маннита до кислоты и газа. Индикатор – Андраде;

Среда Ресселя (Индикатор – бромтимоловый синий): Скос имеет неизмененный цвет, а столбик - желтый цвет. В толще – газ, что свидетельствует о разложении фруктозы до газа и кислоты, лактоза – неферментированна.

______________________________________________

Газовая гангрена

______________________________________________

Среда Китта-Тароцци: жидкая среда для культивирования анаэробов. Для ее приготовления нарезанную мелкими кусочками печень (мясо) заливают трехкратным количеством МПБ, кипятят 30 мин, фильтруют. Просушенные кусочки печени раскладывают (для адсорбции кислорода) в пробирки и заливают бульоном. Стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. Перед использованием прогревают и заливают стерильным нейтральным парафиновым маслом.

На данной среде обнаружен рост в виде помутнения. Также есть газообразование.

______________________________________________

Ботулизм

______________________________________________

Среда Вейнберга: полужидкая питательная среда, применяемая для культивирования патогенных анаэробов, представляющая собой мясопептонный бульон, содержащий 1% агара и 0,2% глюкозы;

В столбике сахарного агара обнаружены мелкие, дискообразные, пушинчатые колонии. Среда разорвана из-за повышенного образования газа при ферментации глюкозы.

Производят распил. Пастеровской пипеткой или иглой берут часть колоний и помещают в среду Китта-Тароцци, для накопления.

______________________________________________

Реакция агглютинации (развернутая)

______________________________________________

NB!: Друзья, не забываем, что читать реакции нужно с конца – проверка контроля сыворотки и антигена. После у вас, скорее всего, спросят определение титра агглютинирующей сыворотки (макси­мальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствую­щим микроорганизмом ) и титра диагностической сыворотки (титр антител к конкретному возбудителю болезни в сыворотке крови, выявляемый у больных и не наблюдающийся у здоровых людей ).

Эталон ответа: Данная реакция представляет собой развернутую реакцию агглютинации. Контроль сыворотки представлен в виде прозрачной жидкости и является отрицательным. В контроле антигена – помутнение, тоже отрицательный. Смотрим разведение 1/100 – прозрачная с зонтиком на дне, при встряхивании - хлопья, значит реакция положительная. И так до 1/6400 . Смотрим разведение 1/12800, заметно помутнение – реакция отрицательна.

Следовательно, реакция агглютинации положительна до разведения 1/6400, при отрицательных контролях, значит титр исследуемой сыворотки - 1/6400.

Реакция агглютинации - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

______________________________________________

Реакция связывания комплимента

______________________________________________

РСК основана на активации комплемента комплексом антиген-антитело.

Проходит в две стадии:

Инкубация смеси: антиген+антитело+комплемент

Индикаторная: выявление одного комплемента путем добавления гемолитической системы (эритроциты барана+гемолитическая сыворотка в тройном титре)

Эталон ответа: Произведен учет РСК с сыворотками больных 1 и 2 для выявления в них антител к соответствующему антигену. Реакция с сывороткой больного 2 – отрицательна, так как в первой стадии антитело и антиген не подошли друг другу и не связались, а значит они и не связали комплемент. Тогда свободный комплемент соединяется с гемолитической системой и происходит лизис. В сыворотке больного 1 обнаружена задержка гемолиза, значит комплекс «антитело+антиген+комплемент» образовался. Комплемент связан и не присоединяется к гемолитической системе. Гемолиз отсутствует. Диагноз положительный.

______________________________________________

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации

______________________________________________

В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума , который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

— питательная среда для выделения, подсчета и различия грамотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.

Состав

В состав среды входят:

• пептон
• Калия фосфат
• лактоза
• Эозин Y
• Метиленовый синий
• Агар-агар

Среда имеет pH около 7 и сохраняется в темноте. Готовая среда имеет красновато-сиреневое окраски, неопалесцирующий с зеленоватым оттенком и легким преципитатом, если в чашках Петри формируется гель.

Назначение и принцип действия

Эта среда разработана американским микробиологом Левином (Levine) и используются для дифференциации Escherichia coli и Enterobacter aerogenes, а также для быстрой идентификации грибов Candida albicans. Американские микробиологи рекомендуют это среда для выделения, подсчета и розрзнення грамотрицательных микроорганизмов кишечной (колиформные) группы. Метиленовый синий и эозин в определенной степени подавляют рост грамположительных микроорганизмов. Эти красители служат в качестве индикаторов расщепления лактозы. На этой среде могут расти в виде точечных колоний дрожжи и некоторые грам-положительные бактерии, например, энтерококки.

Микробиолог Велд (Weld) предложил использовать агар Левина с добавлением хлор-тетрациклина гидрохлорида для быстрой идентификации грибов Candida albicans в клиническом материале. Выявление этих грибов в таком материале, как фекалии, оральный и вагинальный секрет, ногти, чешуйки кожи и другое возможно через 24-48 часов при инкубации при 35-37 ° С в атмосфере, содержащей 10% углекислого газа. Однако культуральные свойства грибов при этом варьируют.

Культуральные свойства

Ростовые характеристики референс-штаммов через 24-48 ч при 35-37 ° С.

Штаммы микроорганизмов (АТСС) Рост

Escherichia coli (25922) Обильный

Pseudomonas aeruginosa (27853) Обильный

Salmonella typhimurium (14028) Обильный

Candida albicans (10231) Хороший или обильный (в атмосфере с 10% углекислого газа)

Enterobacter aerogenes (13048) Хороший

Staphylococcus aureus (25923) Слабый или отсутствует

Saccharomyces cerevisiae (9763) Слабый или отсутствует

Enterococcus faecalis (29212) Подавляется